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    口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒说明书

    发布时间:2017-4-12 14:45:00??????浏览次数:


    一 、试剂盒内含物

    .说明书亚洲 1 型口疫阳性对照血清己稀释浓度为 1:8)

    .96  ELISA 亚洲 1 型口蹄疫阴对照血清

    .液体稀释槽3% 氧水

    .U 96孔抗原抗体反应板25×PBST洗涤液(稀释时准确量取)

    .封板膜豚鼠抗血清稀释液

    .灭活亚洲型口蹄疾病毒抗 (决包裹 )终止液

    .亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒兔抗血清包被缓冲液(碳酸盐)胶囊

    .亚洲口蹄疫病毒豚鼠抗血清底物 (柠檬酸 -磷酸盐)缓冲片剂

    .兔抗豚鼠血清IgG-辣根过氧化物酶结合物OPD片剂

    二、器材准备 ( 需用户自备 )

     1.移液器:5-50μl移液器、0.210μl移液器、50200μl移液器、50300μ12道移液器各一把。

     2.移液枪 (若干)

     3.抗体反应板:微量血凝板(U型、V型均可)5,本试剂盒配备两块,用于被检血清的稀释和抗抗体反应。注:抗原抗体反应板可重复使用,实验后,用水冲洗干净,然后用无离子水沸水浴30,晾干,待用。

     4.纯水 , 无离子水或蒸馏水。

    试剂准备(需用户完成)

    1.包被缓冲液(PH9.6)

       将本试剂配备的碳酸盐缓冲液胶囊1粒小心打开,将胶囊内粉末倒入100ml无离子水中溶解即可。4存放,1月内有效。

    2. 洗涤液(PBST)

       将本试剂盒配备的 25 倍浓缩 PBST (可能有结晶形成,用时微热溶化)用无离子水或蒸水做1:25稀释。(如果PH降低,务必用NaOH调至7.4)

    3.底物溶液

      取1柠檬酸盐片剂(本试剂盒配备)溶于100mL无离子水中,溶化后,50mL溶液再加1片邻苯二(OPD)片剂,充分溶解,分装5mL/ 瓶或 10Ml ), 避光之-2O℃保存。用前光溶化 ,时每1mL上述溶液加 10μL本试剂配备的 3% 双氧(H202务必加双氧水!

    操作步骤

     1.用包被缓冲液稀释亚洲 1 口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度(1:1000),  ELISA 板上每孔加 50μl振荡 , 封板或湿室温过夜。

    2. 抗体(阴阳性对照血清及待检血清)反应

    根据不同的需要,选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作

    196 孔酶标板检测 10 份样品布局图


    S1 1:8

    S2

    S3

    S4

    S5

    S6

    S7

    S8

    S9

    S10

    +1:32

    -1:4

    1:16

    164

    1:8

    1:32

    1128

    1:64

    1256

    1:128

    1512

    1:256

    1:1024

    1:512

    1:2048

    1:l024

    1:4096


    为抗体滴度测定 (定量检测 10 份样品布局图; 2 为抗体滴度测定定量 )检测 20 份样品布局图。

    296 孔酶标板检测 20 份样品布局图


    S11:32

    S2

    S3

    S4

    S5

    S6

    S7

    S8

    S9

    S10

    +1:32

    -1:4

    1:64

    1:64

    1:8

    1:128

    1:128

    1:256

    1:256

    S111:32

    S12

    S13

    S14

    S15

    S16

    S17

    S18

    S19

    S20

    1:512

    1:64

    1:1024

    1:128

    1:2048

    1:256

    1:4096


    以图为例 ,  U 型血凝板上按 50 μl/孔量用 PBST 将待检 血清从1:4开始做2倍连续稀释至 1:512。同时,按图示稀释阴阳对照血清 , 然后每加入 50 μl PBST 稀释到使用浓度的亚洲型口疫病毒抗原 (1:4,1份病毒抗、加3PBST), 病毒抗对照孔加100μl。振荡混匀,封板,4℃过夜。加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:8开始的2倍稀释。

    3.用洗涤液 (1×PBST)  ELISA,在洗水纸上甩干,再将抗抗体混合物从抗抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔,每孔50μl封板,37温育1小时。

    4.同上洗5甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释亚洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度 (1:1000), 孔加50μl,封板,37温育1小时。

    5.同上洗 5  , 甩干。用 l×PBST 稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度 (1:500), 孔加 50 μl封板 ,37 温育 1 小时。

    6. 同上洗板5,孔加50μl底物溶液 (务必加双氧水),37温育15分钟。每孔再加50μl终止液终止反应,立即在492nm波长下读取光吸收值(OD492nm)

    五、结果判定

    1. 试验认可标准

    每块板设 4 孔病毒抗原对照,病毒抗原对照不加任何血清,直接用PBST稀释至使用浓度,与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔,50μl/,病毒抗原对照OD492nm 值应在1.5±0.5范围内。 阳性对照抗体效价应在1:1024±1滴度以内,阴性对照血清抗体效价应<1:8

    2.病毒抗原对照平均OD492nm 50%计算(临界值)

    抗原对照是4,弃去最高和最低OD492nm,计算剩余2孔的平均OD492nm,再除以2,50%对照值。该值即为临界值,表示阻断50%反应的对照OD492nm值。

    3.结果判定

    以病毒抗原对照平均OD492nm 值的50%为临界值,被检血清稀释孔OD492nm值大于临界值的孔为阴性孔,小于或等于临界值的孔为阳性孔,阳性孔的OD492nm值等于临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。例如病毒抗原对照平均OD492nm值为1.2,则其50%0.60。若某一待检血清在1:128OD492nm值为0.6,则该份待检血清的抗体滴度为 1:128 。若临界值处于两个滴度之间 ,如处于1641128之间,则抗体滴度取中间值为1:9O。定性检测中 , 两个重复孔只要有 一孔为阳性孔 , 则抗体滴度判 定为 1:128, 两孔均为阳性孔 , 则判定 为抗体滴度>1:128 

    ELISA抗体效价≥1:128,判定为亚洲 1 型口蹄疫抗体阳性。

    ELISA抗体效价与保护力的关系:牛、羊:抗体效价≥1:128,99% 保护;效价≤1:16, 不保护;效价在1:22-90之间,50%保护。


    猪瘟正向间接血凝试验试剂使用说明书

    一、原理

    用己知血凝抗原检测未知血清抗体的试验,称为正向间接血凝试验,亦称间接血凝。抗原与其对应的抗体相遇,在一定条件下形成抗原——抗体复合物。但这种复合物的分子团很小人肉眼看不见。将抗原吸附(致敏)在红细胞表面,制成猪瘟血凝抗原,用于检测免疫动物血清中的猪瘟抗体水平。

    这种经过猪瘟抗原致敏的红细胞与猪瘟抗体相遇,红细胞便出现清晰的凝集现象。

    二、适用范围

    主要用于检测猪瘟免疫抗体效价,以便制定正确的免疫程序,保障猪群免遭猪瘟强毒的感染。

    三、试验器材,

    196110V型医用血凝板,与血凝板大小相同的玻板。

    21微量移液器(50微升、25微升)取液塑料咀。

    3、微量振荡器。

    4猪瘟血凝抗原

    5猪瘟阴性对照、血清。

    6猪瘟阳性对照血清。

    7、稀释液。

    8、待检血清(每头约0.5ml血清即可)。

    四、试验方法

    1、加稀释液

    在血凝板上16排的19孔;第7排的14孔第6孔;第8排的112孔各加稀释液50微升。

    2、稀释待检血清

    1号待检血清50微升加入第1排第l孔,并将塑咀插入孔底,右手拇指指轻压弹簧12次混匀(避免产生过多的气泡),从该孔取出50微升移入第2孔,混匀后取出50微升移入第3孔……直至第9孔混匀后取出50微升丢弃。此时第114孔待检血清的稀释度(稀释倍数)依次为:1:21)、1:4(2)1:8(3)1:16(4)1:32(5)1:646)1:128(7)1:256(8)1:512(9)

    2号待检血清加入第2:3号待检血清加入第3排……均按上法稀释,注意!每取1份血清时,必须更换塑咀一个。

    3、稀释阴性对照血清

    在血疑板上的第7排第1孔加阴性血清50微升,对倍稀释至第4孔,混匀后从该孔取出50微升丢弃。此时阴性血清的稀释倍数依次为1:2(1)1:4(2)1:8(3)1:16(4)。第6孔为稀释液对照。

    4、稀释阳性对照、血清

    在血凝板上的第8排第1孔加阳性血清50微升,对倍稀释至第12孔,混匀后从该孔取出50微升丢弃。此时阳性血清稀释倍数依次为1:21:4096

    5、加血凝抗原

    被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血请各孔、稀释液对照孔均各加血凝抗原(充分摇匀,瓶底应无血球沉淀)25微升。

    6、振荡混匀

    将血凝板置于微量振荡器上振荡12分钟,如无振荡器;用手轻轻摇匀亦可。然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀,不出现血球沉淀为合格。盖上玻板,室温下或37下静置1.52小时判定结果,也可延至翌日判定。

    7、判定标准

    移去玻板,将血凝板放在白纸上,先观察阴性对照血清1:16孔,稀释液对照孔,均应无凝集(血球全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点),或仅出现凝集(血球大部沉于孔底,边缘稍有少量血球悬浮)

    阳性血清对照、1:21:256各孔应出现“++++++”凝集为合格,(少量血球沉入孔底,大部血球悬浮于孔内)

    在对照孔合格的前提下,再观察待检血清各孔,以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。例如1号待检血清15孔呈现“++++++”凝集,67孔呈现“++”凝集,第8孔呈现“+”凝集,第9孔无凝集,那么就可判定该份血清的猪瘟抗体效价为1:128

    接种猪瘟疫苗的猪群免疫抗体效价达到1:16(即第4)呈现“++”凝集为免疫合格。

    五、检测试剂性能要求

    1、性状

    (l)液体血凝抗原:摇匀呈棕红色(或咖啡色),静置后,血球逐渐沉入瓶底。

    (2)阴性对照血清:淡黄色清亮稍带粘性的液体。

    (3)阳性对照血清:微红或淡黄色稍混浊带粘性的液体。

    (4)稀释液:淡黄或无色透明液体,低温下放置,瓶底易析出少量结晶,在水浴中加温后即可全溶,不影响使用。

    2、包装

    ()液体血凝抗原:摇匀后即可使用,5ml/瓶,每瓶检测3040头份血清。

    (2)阴性血清:2ml/瓶,直接稀释使用。

    (3)稀释液:100ml/瓶,直接使用4保存。

    3、保存条件及保存期

    (l)液体血凝抗原:4保存(切勿冻结),保存期4个月。

    (2)阴性对照血清:-15-20保存,有效期2年,4保存有效期半年。

    (3)阳性对照血清:-15-20保存,有效期2年,4保存有效期半年。

    六、注意事项

    1、为使您的检测获得正确结果请您在检测前仔细阅读本说明书。

    2、严重溶血或严重污染的血清样品不宜检测以免发生非特异性反应。

    3、勿用90130血凝板以免误判结果。

    4、本法可单独检测猪瘟抗体水平也可同步检测口蹄疫免疫抗体水平。

    5、用过的血凝板应及时在水龙头下冲净血球。再用蒸馏水或去离子水冲洗2甩干水份放37恒温箱内干燥备用。检测用具应煮沸消毒37干燥备用。

    6、每次检测只做一份阴性、阳性和稀释液对照。、

    -”表示完全不凝集或010%血球凝集;

    +”表示10-25%血球凝集;+++”表示75%血球凝集;

    "++"表示50%血球凝集;++++”表示90100%血球凝集


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